Modelo estadístico para estimar el impacto histórico de la influenza sobre la mortalidad en Cuba / Statistical model to estimate the historical impact of influenza on mortality in Cuba

Introducción: La influenza tiene elevado impacto en la mortalidad humana y en Cuba la categoría influenza y neumonía ocupa el cuarto lugar entre sus causales generales. En los países templados, con marcada estacionalidad, esto se capta con modelos estadísticos, tarea que se dificulta en el trópico y pendiente en Cuba por la ausencia de igual definición estacional. Objetivo: Estimar el impacto histórico de la influenza tipo A y B y los subtipos A(H3N2) y A(H1N1) sobre la mortalidad mediante el ajuste de un modelo de regresión a las condiciones estacionales específicas de Cuba. Métodos: Se ejecutó un estudio longitudinal y retrospectivo. En un primer paso se ajustaron dos modelos de Poisson con la mortalidad influenza y neumonía total y las personas ≥ 65 años de edad como variables respuestas en los cinco meses de mayor positividad en influenza, desde la temporada 1987-1988 hasta la 2004-2005 y los positivos en tipo A y en tipo B como explicatorias. En otro par de modelos se estimó el impacto del A(H3N2) y el A(H1N1), considerando como respuesta los fallecidos atribuidos previamente al tipo A. Resultados: Se atribuyeron a la influenza 7803 fallecidos entre todas las edades y 6152 entre las personas ≥ 65 años de edad, con un 56,3 por ciento asociados al A(H3N2), el 17,6 por ciento al A(H1N1) y el 26,1 por ciento al tipo B. Conclusiones. Se logró estimar el impacto de la influenza sobre la mortalidad mediante el ajuste para Cuba de un modelo estadístico que permitió demostrar la asociación de la circulación de estos virus con la mortalidad en el país, lo que ratifica la necesidad de reforzar la vigilancia, el control y la vacunación contra esta infección viral. Se demuestra la posibilidad de ajustar estos modelos de regresión a otros virus respiratorios y a la actual pandemia por la COVID-19, en las condiciones estacionales de Cuba(AU)

Introduction: Influenza has a high impact on human mortality and in Cuba influenza and pneumonia rank fourth among its general causes. In temperate climate countries, with marked seasonality, this is captured by statistical models, a task that is difficult in the tropics and pending in Cuba due to the absence of the same seasonal definition. Objective: Estimate the historical impact of influenza type A and B and subtypes A(H3N2) and A(H1N1) on mortality, by adjusting a regression model to the specific seasonal conditions of Cuba. Methods: A longitudinal and retrospective study was performed. In a first step, two Poisson models were adjusted with influenza and total pneumonia mortality and people ≥ 65 years old as response variables in the five months with the highest positivity to influenza in the period 1987-1988 to 2004-2005, and the positive ones to type A and type B as explanatory variables. In another pair of models was estimated the impact of A(H3N2) and A(H1N1), considering as a response the deaths previously attributed to type A. Results: 7 803 deaths among all ages and 6 152 among 65-year-olds were attributed to influenza, with 56.3 percent associated to A(H3N2), 17.6 percent to A(H1N1) and 26.1 percent to type B. Conclusions: It was possible to estimate the impact of influenza on mortality by adjusting for Cuba a statistical model that demonstrated the association of the circulation of these viruses with the mortality in the country, which confirms the need to strengthen surveillance, control and vaccination against this viral infection. The possibility of adjusting in the seasonal conditions of Cuba these regression models to other respiratory viruses and the current pandemic by COVID-19 is demonstrated(AU)

Introducción de nuevos ensayos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para el diagnóstico y vigilancia de virus respiratorios / Introduction of new assays of real time polymerase's chain reaction for the diagnosis and surveillance of respiratory viruses

Las infecciones respiratorias agudas constituyen la causa fundamental de mortalidad y morbilidad en el ámbito mundial. Los principales agentes causales de estas infecciones son los virus. La detección rápida y eficaz de estos patógenos es determinante en el tratamiento y la prevención de las enfermedades que estos agentes virales pueden ocasionar. En la actualidad, los métodos moleculares para el diagnóstico virológico son muy útiles por su elevada sensibilidad, especificidad y rapidez en la obtención de los resultados. El objetivo es introducir cuatro ensayos múltiples de transcripción reversa de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para el diagnóstico y vigilancia de 15 virus respiratorios. Se procesaron 2 441 muestras clínicas respiratorias recibidas en el Laboratorio Nacional de Referencia de Virus Influenza y otros Virus Respiratorios en el período comprendido entre septiembre de 2013 y abril de 2014. Se analizaron 2 352 exudados nasofaríngeos, 77 aspirados bronquiales y 12 muestras de necropsia. A estas se les realizó el diagnóstico molecular por los sistemas múltiples de transcripción reversa de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real mediante el empleo de cebadores y sondas TaqMan. De las 2 441 muestras clínicas estudiadas, 1 290 fueron positivas para alguno de los virus respiratorios (52,85 por ciento). El virus sincitial respiratorio humano se detectó con mayor frecuencia (47,83 por ciento), seguido de los virus influenza (19 por ciento) y los rinovirus humanos (14,73 por ciento). Se concluye que la introducción de los cuatro ensayos de transcripción reversa de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real posibilita la actualización del algoritmo diagnóstico en el Laboratorio Nacional de Referencia de Virus Influenza y otros Virus Respiratorios para la vigilancia de estos agentes en Cuba, lo que contribuye al mejoramiento del Programa Nacional de Prevención y Control de las Infecciones Respiratorias Agudas(AU)

Acute respiratory infections are the major cause of mortality and morbidity worldwide. Respiratory viruses are the main causative agents of acute respiratory infections. Rapid and accurate detection of these pathogens is critical for the treatment and prevention of the diseases these viral agents can cause. Currently, molecular diagnostic methods are useful tools for the virological detection of respiratory viruses due to its high sensitivity, specificity and their speed in obtaining results. The objective of this study was to introduce four multiplex real-time TR-RCP assays for the diagnosis and surveillance of fifteen virus causing acute respiratory infections. 2 441 clinical respiratory samples were processed in the period between September 2013 and April 2014 in the National Laboratory of Reference for Influenza Virus and other Respiratory Viruses. There were analyzed 2 352 nasopharyngeal exudates, 77 bronchial aspirations and 12 necropsy samples. Multiplex real-time TR-RCP was performed using TaqMan primers and probes previously published. From the 2 441 clinical samples studied, 1 290 were positive for some of the respiratory viruses, which represent 52.85 percent Syncytial respiratory virus was the most frequently detected virus (47.83 percent), then influenza viruses (19 percent) and human rhinovirus (14.73 percent). The introduction at the National Reference Laboratory of the four multiplex real-time TR-RCP assays allows updating the algorithm for the diagnosis and surveillance of respiratory viruses in Cuba, as a contribution to the National Program for the Prevention and Control of Acute Respiratory Infection(AU)

Diagnóstico molecular del virus influenza A (H1N1) 2009 y otros vírus respiratorios, durante la primera ola pandémica en Cuba / Molecular diagnosis of influenza A (H1N1) 2009 virus and other respiratory viruses during the first pandemic wave in Cuba

Introducción: el primer virus pandémico del siglo XXI, el virus influenza A (H1N1)/2009, emergió en México, a finales del mes de abril de 2009, después de un triple reordenamiento entre virus de influenza de origen aviar, humano y porcino, y desde allí se diseminó por el mundo. Frente a ese evento, en Cuba, se adoptaron medidas determinantes antipandémicas, entre ellas, se reforzó la vigilancia virológica con todas las acciones necesarias. Objetivos: detectar y confirmar la entrada del agente causal de la pandemia en el país, de forma rápida, oportuna y además, definir la participación de otros virus en la etiología de las infecciones respiratorias agudas. Métodos: como consecuencia de la vigilancia de laboratorio, entre las semanas epidemiológicas 38 a la 42 de 2009 (meses de septiembre y octubre) se procesó un total de 1 063 muestras clínicas respiratorias (exudado nasofaríngeo, aspirado bronquial y muestras de necropsia de pulmón), detectándose el mayor número de casos confirmados de infección por el nuevo virus en este período, que se correspondió con la primera oleada pandémica en Cuba. El diagnóstico virológico se realizó utilizando un algoritmo de diagnóstico molecular. Resultados: de las 1 063 muestras, 597 (56,0 por ciento) resultaron positivas. El virus de influenza pandémica A(H1N1)2009, fue el agente etiológico detectado con mayor frecuencia en 306 casos sospechosos (51 por ciento), seguido por el virus influenza A(H3N2) en 228 pacientes(38 por ciento). Otros virus respiratorios se diagnosticaron en 63 muestras clínicas (11 por ciento). El virus pandémico se confirmó en 50 gestantes. Los rinovirus se detectaron con mayor frecuencia en muestras de pacientes con diagnóstico clínico de bronconeumonía y bronquiolitis. Durante el período estudiado se reportó un incremento de la morbilidad, se notificaron 225 825 atenciones médicas por infección respiratoria aguda a mediados del mes de octubre. Conclusión: el algoritmo de diagnóstico molecular empleado para la confirmación de los virus influenza y otros virus respiratorios demostró ser sensible, específico y efectivo para garantizar la vigilancia virológica sistemática en nuestro país durante la fase pandémica.

Introduction: the first pandemic virus of the 21st century - the influenza A (H1N1)/2009 virus-appeared in Mexico in April 2009 after triple reassortment of influenza strains of avian, human and pig origin and from there, it was spread worldwide. With the purpose of facing up to this event, Cuba adopted anti-pandemic measures including the virology surveillance using all necessary actions. Objectives: the detection and validation of the entry of the causative agent of pandemic into the country in a fast and timely way, in addition to the definition of involvement of other viruses in the etiology of acute respiratory infections. Methods: as a result of the lab surveillance, from the 38th to the 42nd epidemiological weeks (September and October, 2009), 1 063 respiratory clinical samples were processed (nasopharyngeal exudates, bronchial aspirates and lung necropsy samples). The highest number of confirmed cases caused by the new virus was detected in this period that represented the first pandemic wave in Cuba. Diagnosis was based on molecular diagnosis algorithm. Results: out of the 1 063 samples, 597 (56.0 percent) were positive. The pandemic influenza A (H1N1) virus was the most commonly detected etiological agent in 306 suspected cases (51 percent) followed by influenza A (H3N2) virus in 228 cases (38 percent). Other respiratory viruses were diagnosed in 63 clinical samples (11 percent). The pandemic virus was confirmed in 50 pregnant women. Rhinoviruses were identified more frequently in those samples from patients with clinical diagnosis of bronchial pneumonia and broncholitis. Morbidity increased during this period; 225 825 medical consultations were notified due to acute respiratory infections mid-October 2009. Conclusions: the molecular diagnosis algorithm proved to be sensitive, specific and effective to assure the systematic virological surveillance in our country during the pandemic phase.

Normalización de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del herpesvirus humano 8 / Standardization of a real-time polymerase chain reaction system for quantification of human herpesvirus 8

OBJETIVO: normalizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar la carga viral del herpesvirus humano 8, en diferentes muestras clínicas de pacientes en los que se sospeche la infección por este agente. MÉTODOS: se evaluaron 3 de los métodos reportados internacionalmente para obtener ADN estándar en la construcción de curvas externas estándar, que permiten determinar el número de copias de ADN diana en la muestra problema. RESULTADOS: se obtuvieron 3 ADN estándar a partir del clonaje de un fragmento del gen ORF26 del herpesvirus humano 8 en un vector (ADN plasmídico), con la utilización de productos purificados de reacción en cadena de la polimerasa y el empleo de ADN genómico de la línea celular BCBL. Se pudieron construir las curvas patrón a partir de cada uno de los ADN estándar obtenidos, los que mostraron una fuerte correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de 6 magnitudes de concentración de ADN diana. El límite inferior de detección a partir del ADN plasmídico y de los productos de reacción en cadena de la polimerasa fue de hasta 100 copias, mientras que con el ADN genómico fue de hasta 10 copias; este último sistema resultó el más sensible. CONCLUSIONES: la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real normalizada a partir de los 3 ADN estándar probó ser un sistema rápido, específico y altamente sensible que permitirá un mejor diagnóstico y además desarrollar estudios sobre la patogenia de la infección por el herpesvirus humano 8 en Cuba.

OBJECTIVE: to standardize a real-time polymerase chain reaction system to determine the human herpes virus 8 viral load in several samples from patients suspected of this type of infection. METHODS: three internationally known methods were evaluated to obtain standard DNA in standard external curve constructions, which allow determining the number of target DNA copies in the suspected samples. RESULTS: three standards DNA were obtained from cloning ORF26 gene fragment of human herpesvirus 8 in a vector (plasmid DNA), with the use of purified polymerase chain reaction products and of genomic DNA of BCBL cell lines. The pattern curves were constructed on the basis of each of the resulting standard DNA, which showed strong linear correlation (r= -1) and very low error values throughout 6 target DNA concentrations. The lower detection limit based on plasmid DNA and the polymerase chain reaction products was 100 copies, whereas that obtained with genomic DNA reached up to 10 copies; this last system turned to be the most susceptible. CONCLUSIONS: real-time polymerase chain reaction system, standardized for the three standard DNA proved to be a rapid, specific and highly sensitive system for better diagnosis, and for the development of studies on the pathogenesis of human herpesvirus 8 infection in Cuba.

Obtención de clones recombinantes que expresan las proteínas prM-E-NS1 del virus dengue serotipo 2 / Obtaining recombinant clones expressing dengue virus serotype 2 prM-E-NS1 proteins

Objetivo: obtener clones recombinantes que expresen diferentes proteínas del virus dengue 2 en un vector de expresión en células eucariotas. Métodos: se realizó el clonaje de los genes prM, envoltura (E) y 65 aminoácidos (aa) de la proteína NS1 del virus dengue serotipo 2 (cepa Nueva Guinea C) en un vector de expresión en células eucariotas pcDNA (3.1). La obtención de los genes correspondientes a la zona prM/E/NS1 y prM/E truncada en 100 aa se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP). La detección de los posibles clones recombinantes se llevó a cabo mediante las técnicas de RCP, análisis de restricción enzimática y secuenciación nucleotídica. Se realizó la transfección de la línea celular CHO con cada plásmido recombinante. Para determinar la expresión transciente de los genes clonados se empleó la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y trascripción reversa-RCP (TR-RCP). Resultados: se obtuvieron bandas de 2 202 y 1 600 pares de bases (pb), respectivamente. Se estudiaron 20 posibles colonias recombinantes, de las cuales, 7 resultaron positivas para prM-E-NS1 y 5 para prM/E truncada. Se obtuvieron células fluorescentes 48 h después de transfectadas, además una RCP positiva a ese mismo tiempo, lo que indicó la presencia de las proteínas en las células transfectadas. Conclusiones: el vector empleado fue eficiente para el clonaje y la expresión de las proteínas seleccionadas, por lo que las construcciones genéticas obtenidas pudieran ser evaluadas en animales como posibles candidatos vacunales para la obtención de una vacuna de ADN contra el dengue.

Objective: To obtain recombinant clones expressing different dengue virus 2 proteins in an expression vector of eukaryote cells. Methods: Cloning of prM genes, E envelope and 65 amino-acids (aa) of dengue virus serotype 2 NS1 proteins (Nueva Guinea strain) in an expression vector of pcDNA eukaryote cells (3.1). The prM/E/NS1 zone and the truncated prM/E zone at 100 aa genes were obtained by polymerase chain reaction (PCR). Possible recombinant clones were detected using PCR, enzyme restriction analysis and nucleotide sequencing. Transfection of the CHO cell line with each recombinant plasmid was performed. Indirect immunofluorescence and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) determined the transient expression of cloned genes. Results: Bands of 2 202 and 1 600 base pairs (bp) respectively were obtained. Twenty possible recombinant colonies were studied, 7 of them were pr-E-NSI-positive and 5 truncated prM/E-positive. Fluorescent cells emerged 48 hours after being transfected in addition to positive PCR, all of which indicated that the studied proteins were present in transfected cells. Conclusions: The used vector proved to be efficient for cloning and expression of the selected proteins; therefore, the obtained genetic constructions could be evaluated in animals as likely vaccinal candidates for a dengue virus DNA vaccine.

Estudio de la estabilidad genética del sistema de expresión de la proteína E del virus dengue 4 en la levadura metilotrófica Pichia pastoris / Study of the genetical stability of the system of expression of protein E of dengue virus 4 in methyltrophic yeast Pichia pastoris

Se realizó el análisis de la estabilidad plasmídica de la levadura metilotrófica Pichia pastoris que expresa la proteína recombinante E del virus dengue 4. Para ello se estimó el número de generaciones desde el proceso de crecimiento en placa petri hasta la propagación en zaranda, así como el proceso de fermentación. Además se determinó en las colonias seleccionadas el patrón de integración por Dot-Blot y secuencia nucleotídica del gen E del virus dengue 4. Este estudio permitió comprobar la conservación e integridad de la secuencia aminoacídica de la proteína E, a pesar de encontrarse cambios genéticos producidos por mecanismos moleculares de la levadura; por otra parte, formó parte del control y chequeo realizado al banco de células primario de levadura que contiene el gen de interés, actualmente utilizado en el proceso de expresión de la proteína E del virus dengue 4

Caracterización intratípica de Poliovirus por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa

Se introdujo la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa para la caracterización intratípica de Poliovirus. Se usaron cebadores que sólo promueven la ampliación de las cepas vacunales de Sabin, comprobada por corrida electroforética de los productos de ADN amplificados (Sabin 1-97 pb, Sabin 2-71 pb, Sabin 3-44 pb) y cuya especificidad se verificó satisfactoriamente. Se estudiaron por esta técnica 23 cepas cubanas de Poliovirus aisladas e identificadas en el Laboratorio de Enterovirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" de 1993 a 1994, y todas resultaron ser del tipo vacunal. Se observó cómo el Poliovirus vacunal de Sabin puede ser causa de meningoencefalitis viral como complicación neurológica más leve. Este estudio aportó una evidencia más a favor de la no circulación del Poliovirus salvaje en Cuba.

The polimerase chain reaction techniques was introduced for the intratypic characterization of Poliovirus. Primers were used only to promote the amplification of the Sabin vaccine strains proved by electrophoretic run of the amplified DNA products (Sabin 1 - 97 pb, Sabin 2 - 71 pb, Sabin 3 - 44 pb) and whose specificity was satisfactorily verified. 23 Cuban poliovirus strains isolated and identified at the Laboratory of Enterovirus of the "Pedro Kourí" Tropical Medicine Institute from 1993 to 1994 were studied by this technique. All of them were of the vaccine type. It was observed how the Sabin vaccine poliovirus may be the cause of viral meningoencephalitis as a milder neurological complication. Tghis study provided one more evidence about the non circulation of the wild poliovirus in Cuba.

Candidiasis esofágica en pacientes con sida. Estudio clínico y microbiológico

Se estudiaron 18 pacientes con sida, que presentaban síntomas gastrointestinales altos o lesiones en la cavidad oral sugestivos de candidiasis. Se obtuvieron datos clínicos, muestras de la cavidad oral, biopsias y cepillado esofágico, así como suero de todos los pacientes. El síntoma que principalmente se observó en la candidiasis esofágica fue la disfagia; la candidiasis oral se comportó de forma asintomática. Candida albicans fue la especie que más se aisló con predominio del serotipo A. Se analizaron por la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida los perfiles proteicos de las 12 cepas pertenecientes a esta especie, se observó identidad de sus patrones de peso molecular, lo que sugiere que sea la misma cepa la que se halla en la cavidad oral y en el esófago. Se evaluó la respuesta de anticuerpos anti-C. albicans, no resultó útil la inmunodifusión doble para el diagnóstico de candidiasis esofágica.

18 AIDS patients who presented high gastrointestinal symptoms or lesions in the oral cavity suggestive of candidiasis were studied. Clinical data, specimen of the oral cavity, biopsies and esophageal brushing, as well as serum from all patients were obtained. Dysphagia was the main symptom observed in the esophageal candidiasis. Candida albicans was the most isolated species with a predominance of serotype A. The protein profiles of 12 strains belonging to this species were analyzed by the polyacrylamide gel electrophoresis, and it was found that their molecular weight patterns were identical, which indicates that the same strain is in the oral cavity and in the esophagus. The response of the anti-C. albicans antibodies was evaluated. The double immunodiffussion was not useful for the diagnosis of esophageal candidiasis.